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Índice da apostila de GMTD
I. CONCEITOS BÁSICOS
1.
Introdução
2.
Conceito de clonagem molecular
3.
Enzimas de Restrição
4.
Construção do DNA Recombinante
5.
DNA ligase
Tipos
de fragmentos de DNA que são ligados pela DNA ligase
a)
Fragmentos com extremidades coesivas
b)
Fragmentos com extremidade não coesivas
6.
Transformação bacteriana
6.1.Conceito
de transformação induzida
6.2.
Mecanismos de captação do DNA
II.
VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR
1.
PLASMÍDEO
2.
FAGOS
2.1
Biologia do fago l
2.2
Genoma do fago l
2.3
Controle de expressão dos genes do fago l
2.4
O uso do fago l como vetor de clonagem molecular.
3.
COSMÍDEO
4.
VÍRUS
4.1.
Clonagem no vírus SV40
4.2.Clonagem
no SV40 pela substituição da região tardia
4.3.
Clonagem no SV40 pela substituição da região precoce
5.
BACTERIÓFAGO M13
5.1.
Clonagem no bacteriófago M13
5.2.
Estratégia de clonagem em vetores da série M13mp.
6.
FAGEMÍDEOS
6.1.
Clonagem no fagemídeo.
7.
VETORES PARA TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS
III.
CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE
1.
Biblioteca de cDNA
1.1.
Síntese de cDNAs de fita dupla
1.2.
Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor
2.
Biblioteca genômica
2.1.
Preparo do DNA inserto
2.2.
Vetores utilizados na construção de biblioteca genômica
IV.
DETECÇÃO e ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE
4.1.
Quando o gene de interesse é expresso no hospedeiro
4.2
O uso de sondas moleculares de ácidos nucleicos para identificar o
gene de interesse
4.3
Análise do DNA e RNA por eletroforese em gel e "blotting".
4.4
Como os genes clonados são utilizados?
4.5.
Mapa de restrição
V.
SEQÜENCIAMENTO DE DNA
5.1
Sequenciamento manual
5.2
Sequenciamento automático
VI.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
VII.
Expressão de proteínas heterólogas
1.
Introdução
2.
Expressão de proteínas heterólogas em E.coli
2.1
Subclonagem em plasmídeos de expressão
2.2
Análise dos plasmídeos e seleção dos subclones
corretos
3.
Produção de proteínas heterólogas em E. coli
3.1.
Produção de proteínas híbridas
3.2.
Produção de proteínas intactas
4.
Expressão de proteínas heterólogas em organismos eucariotos
4.1.
Expressão em células de mamíferos
4.2
Expressão em fungos
5.
Sistema de expressão em células de inseto utilizando Baculovírus
como vetor
6.
Expressão em células de Drosophila
7.
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS - APLICAÇÕES
E PERSPECTIVAS
7.1-
bibliotecas de expressão e identificação de novas proteínas
através de anticorpos ou outros ligantes específicos
7.1.1-
Sistema convencional - expressão de biblioteca de cDNA em E. coli
7.1.2-
Novos sistemas para a detecção de receptores ou proteínas
ligantes
7.2.
A utilização da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento
de receptores de membrana
7.3.
Expressão de proteínas para intervenção terapêutica
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
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